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透射电镜样品制备技术
编辑: 文章来源: 点击数: 更新日期:2019-06-10

1. 生物样品负染

滴在铜网上的样品溶液经1-2%的磷钨酸(PTApH6.5-7.0)染色5-10s后干燥,在透射电镜中观察。

2. 生物样品超薄切片制备流程

材料样品的超薄切片制备参见步骤2.42.5

样品取材要求:

1)新鲜。(材料离体后1-5min内进入固定液,避免细胞自溶和结构变化)

2)体积小。(厚度<1mm ,长度宽度均<5mm ,固定液渗透能力有限,组织太大会导致无法固定充分)

3)机械损伤小。(动作轻巧,器械锋利,避免对阻止的挤压和推拉,建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。)

4)低温操作,器械、容器、固定液均需预冷。(降低酶的活性,减少组织自溶)

5)取材部位准确,且注意材料的方向性和定位。

2.1取样&固定:

2.1.1取样及戊二醛固定

戊二醛(多为2.5%),超纯水配成6-10%的水溶液,使用前加0.2M磷酸钠缓冲液稀释至所需浓度(有细胞壁的样品5%,无细胞壁样品3%,磷酸缓冲液终浓度0.1MPH7.2),现配现用。可根据样品选择其他缓冲体系。

切取一小块组织,置入预冷的戊二醛固定液(3-5%)中,4℃预固定20分钟后,捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上(已滴有预冷的固定液),在固定液中用将组织切成2-5mm长, 2-3mm宽, 1mm厚的细条,移入盛有预冷的戊二醛固定液的2ml离心管中,4℃固定过夜。

1)植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气,往往使材料漂浮于固定液面之上,由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后,可用真空泵抽出组织内部的气体,使材料沉入固定液中。

2)动物样本的取材,可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。

3)细胞培养的样品,轻微并短暂离心,倒净培养液后,加入预冷的固定液,4℃固定10min后,低温6000rpm/min离心5min(离心力不可过大,离心时间不可过长,避免机械挤压,使用1.5ml离心管方便收集细胞),去上清,滴加新鲜固定液并重悬,4℃固定过夜。

漂洗

2.1.2锇酸固定

倒掉固定液,用0.1MpH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min。用1%的锇酸溶液固定样品1-2h。小心取出锇酸废液,用0.1MpH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min

2.2.脱水

用梯度浓度(包括30%50%70%80%90%95%五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用100%的乙醇处理20min;最后过度到纯丙酮处理20min

2.3渗透

用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1/1)处理样品1h:用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3/1)处理样品3h;纯包埋剂处理样品过夜。

2.4包埋和聚合

将经过渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜,即得到包埋好的样品。

2.5切片和染色

包埋块在超薄切片机中切片,获得100nm的切片,切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5-10min,即可在透射电镜中观察。

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