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生物分子的分离与检测技术
编辑:澳门赌搏网站大全 文章来源:澳门赌搏网站大全 点击数: 更新日期:2012-06-25
 
21世纪是生命科学的世纪,生命科学的发展离不开研究手段(主要是分离、分析、测试手段)的创新和发展。而分析方法的发展也推动了生命科学的研究向更高、更深入的层次进展。20世纪90年代末期诞生的系统生物学(systems biology)包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学和生物信息学,分别通过基因、蛋白质和代谢产物水平上的整体分析来研究和探索生命的现象和本质。针对这些复杂的生物体系,首先要解决的重大问题是生物系统物质组成的高通量分离分析和结构鉴定。生物分子识别作用与其生物功能的产生密切相关,因此从分子水平上建立高通量、高灵敏度的生物活性分子相互作用研究与分析的新技术和新方法是生物分析化学的一大发展趋势。当代物理学、数学、电子学、生物学以及工程科学的发展,促使大量新的分析方法、技术和原理不断涌现出来。如激光技术的引入,促进了诸如激光共振电离光谱、激光诱导荧光光谱和激光质谱的开展,大大提高了分析方法的灵敏度,使得检测单个原子或单个分子成为可能。以下对生物活性分子分离与检测领域的一些新技术和新方法进行先容。
1 现代色谱分析技术
由液相色谱、气相色谱、超临界流体色谱和毛细管电泳等所组成的色谱学是现代分离、分析的主要组成部分。应生命科学高速发展的要求,近年来色谱分析技术也取得了许多新的进展。尤其是在基因组、蛋白质组以及代谢组学的研究中,大量新的高选择性、高分辨率色谱技术发挥着不可替代的作用。
1.1 毛细管电泳技术
毛细管电泳(CE)是目前对生物大分子分辨效率最高的分离分析技术。由于CE采用极细内径的弹性石英毛细管作为分离载体,进样量小,可操作性强,分离快速、高效,因而在蛋白质分离、糖分析、DNA测序、单细胞分析中发挥着越来越重要的作用。其分离效率可达百万理论塔板,进样体积只需nL,并且易于同其他检测方法联用,最低检测限可达10-19mol,是微分离分析中最有效的方法之一。
近年来,CE技术已被应用于基因组、蛋白质组以及代谢组学的研究中,其中阵列毛细管电泳、亲和毛细管电泳、芯片毛细管电泳以及和其他高灵敏检测技术的联用最为引人注目。阵列毛细管电泳平台可允许同时操作多根毛细管进行分析,大大提高了分离分析的效率。正是这种技术的发展实现了高通量的DNA测序,使人类基因组计划提前完成。亲和毛细管电泳是研究生物活性分子间相互作用的有效手段。这种方法样品消耗量小、速度快、柱效高并且所用溶液体系非常接近生物体液组成,可以得到较为真实的生物分子相互作用信息,已被用于生物活性物质如蛋白质、核酸、糖类等与药物分子之间的相互作用的研究。
CE和激光诱导荧光技术的联用已经实现了单分子水平的检测,其检出限可达10-12mol/LCE与质谱(MS)的联用也是一个令人兴奋的技术。它能在高效分离的同时在线提供化合物的结构信息,在肽链测序及蛋白结构、相对分子质量测定、单细胞分析等方面有卓越的表现。Smith等用毛细管等电聚焦与超高精确度和灵敏度的电喷雾傅里叶离子回旋共振质谱联用,分析了大肠杆菌蛋白质表达的变化。芯片毛细管电泳将电泳操作进一步缩小至芯片上的微通道中,由于分离通道短、场强大,因此分离速度更快、效率更高,是目前微全分析系统(μ-TAS)的主流技术。HaabMathies将单分子检测与芯片毛细管电泳相结合,利用芯片本身的微通道迫使更多的分子通过检测区,同时利用鞘流聚集技术使单分子检测效率从毛细管电泳的0.01%提高到了1.1%。此外,利用CE技术分析细胞代谢产物中某些改性核苷含量的变化,有可能应用于肿瘤以及艾滋病的诊断。
毛细管电色谱(CEC)是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相,依靠电渗流推动流动相,使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、分配平衡常数和电泳速率的差异而达到分离分析的一种电分离模式。它结合了CE的高效性和高效液相色谱(HPLC)的高选择性,具有高效、快速、微量的特点,是一种新兴的微柱分离分析技术。CEC技术也将逐步在本世纪内生物分子的分离分析中获得应用。
1.2 多维色谱技术
尽管近年来HPLCCE技术的进展为生物活性分子的分离分析提供了有效的手段,但是面对非常复杂的体系,一维的分离模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限。Giddings曾指出,用一维分离方法对含有100个随机分布组分的样品进行分离,完全分离82个组分就需要有大约四百万的理论塔片数。因此,单纯从目前的分离手段出发不足以对复杂样品体系中随机峰组分进行完全分离。根据Giddings建立的数学模型,多维分离模式的峰容量是其构成的各个一维分离模式的峰容量的乘积,因此多维色谱相比于一维色谱能提供更大的峰容量,更适合于复杂样品的分析。根据分离机理的不同,可以将多维分离模式大致分为多维HPLC、多维CE以及多维HPLC-CE三大类。
1.2.1 多维高效液相色谱
同一维HPLC系统相比,多维HPLC系统最主要的优势在于提供了不同寻常的峰容量。这使得大多数目标化合物和化合物族可以获得基线分离。同时组分峰在多维分离空间中被多重定位,减少了干扰,定性可靠。另外,相对于同族的其他化合物来说,每个峰在每次运行中其位置是稳定的,容易识别。因此,多维HPLC技术已经广泛地应用于复杂样品的分析研究中,特别是蛋白质组学研究和药物分析方面。与传统二维凝胶电泳相比,多维HPLC系统最突出的优点是:(1)快速,灵敏,便于自动化,能够满足蛋白质组学研究高通量的要求。(2)对蛋白质全组分进行分析时的歧视效应大大减小。从目前的发展方向看,多维HPLC?/FONT>MS联用有望成为蛋白质组学分离技术的一个新的生长点,而且越来越受到关注。Regnier等人建立了全自动化特征肽鉴定蛋白质的方法,利用多维HPLC技术对复杂体系中蛋白质鉴定所需的还原和烷基化反应、胰蛋白酶酶解、固载化金属亲和色谱、反相色谱以及电喷雾电离椫势?/FONT>(ESI-MS)分析等全流程操作实现了在线
自动化。整个系统中可以任意在其中的一个步骤添加多根柱子,并联运行以实现高通量分析。该方法对脱脂牛奶中蛋白质鉴定的全过程不超过2h,耗时仅为传统方法的十分之一。Yates等人将不同的色谱分离模式以串联方式合并于同一色谱柱中进行,即在同一色谱柱的前半部分装填强阳离子色谱填料,后半部分填充反相色谱填料。经酶解的多肽混合物进样到强阳离子交换柱,以台阶梯度增加盐浓度,依次将馏分直接洗脱进入反相色谱填料上,线性增加乙腈浓度,对反相色谱填料上有保留的组分进行洗脱分离,并由质谱鉴定。这种方法称为多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technologyMudPIT),一个分析周期可检测100多种蛋白质,适用于蛋白质组学研究中蛋白质的大规模分离鉴定。Koller等人利用MudPIT方法进行了水稻蛋白质组研究,同时还与传统的经二维凝胶电泳分离,质谱鉴定的方法进行了结果比较。传统方法识别了556个水稻蛋白质(1509个肽段),而MudPIT方法共检出和识别了2363个水稻蛋白质(5189个肽段),这是至今由多维HPLC技术鉴定蛋白质数目最多的文献报道,充分体现了多维色谱在蛋白质组研究中的巨大潜力。
多维HPLC也适用于对含有相对简单目标化合物的混合物进行快速扫描分析。在对富含蛋白质的体液,如血浆等样品中的药物进行药代动力学分析时,往往需要进行复杂的样品预处理,存在着过程复杂、耗时长等缺点。Stopher等利用多维色谱的柱切换功能,在第一维柱上将待测药物与干扰的生物大分子进行分离,然后在后续柱上完成样品分析,从而实现了血浆样品直接进样检测。在对生物样品中的对映体进行拆分时,由于内源性物质及代谢产物的干扰,仅由手性色谱柱拆分容易造成谱峰重叠,将手性拆分柱与常规分析柱串联组成的多维色谱系统已经成功地解决了这一问题。
1.2.2 多维毛细管电泳
和多维HPLC相比,多维CE在蛋白质组研究中的应用正处于起步阶段。Sheng等用毛细管胶束电泳和毛细管等电聚焦在线二维分离模式在4min内完成了对一种蛋白质水解产物的浓缩、分离和检测。Mohan等通过微透析界面实现了毛细管等电聚焦和毛细管区带电泳的二维分离模式并将该模式应用到蛋白水解肽的分析中,峰容量可以达到1600左右。张玉奎等采用中空纤维膜实现了毛细管等电聚焦和毛细管凝胶电泳的二维连接,并用于li'I蛋白的多态性研究。
1.2.3 多维高效液相色谱-毛细管电泳?
多维HPLC-CE系统是由Jorgenson等提出的。它们设计了两种不同的接口椃?/FONT>/环设计和横向流控界面,实现了反相色谱和毛细管区带电泳二维分离模式以及排阻色谱椃聪嗌?讞毛细管区带电泳三维分离模式,并将它们用于蛋白质降解产物的分析中。Chen等以微进样器作为接口建立了毛细管等电聚焦和毛细管反相色谱二维分离体系并将其应用于从果蝇唾液腺中提取的肽类样品的分析,峰容量可达约1800Stahl等实现了排阻色谱-口压电色谱-质谱多维分离模式。
1.2.4 多维液相分离系统的微型化
由于微型化分析仪器具有分析速度快、高通量、易于优化设计、样品及试剂消耗少等优点,近来发展十分迅速。多维分离系统的微型化工作也已经开展。Ramsey研究组将胶束电动色谱和快速CE这两种分离模式设计在玻璃芯片上构成了全二维微型分离装置,与单独采用任意一维分离模式相比大大提高了系统的分辨率。该装置可以电动控制进行自动化分析,对多肽混合物的分析时间在10min之内,全系统的峰容量大约为5001000S1entz等将固载化胰蛋白酶酶解、固定化金属离子螯合亲和色谱、反相色谱分离等三维操作系统集成在聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片上,构成多维微全分析系统,并对牛血清白蛋白样品进行了全自动芯片蛋白质酶解组分分析的尝试。
1.3 生物色谱技术
生物色谱是利用生物活性物质的特异性相互作用进行生物样品分离分析和生物活性参数测定的新兴技术。Zou等将牛生长激素释放因子及其抗体固载到灌流色谱填料上,发展出快速测定牛生长激素释放因子及其抗体的免疫亲和色谱法,该方法还被用于分离纯化牛生长激素抗体与酶的共价聚合物。同时通过对牛生长激素释放因子的抗体进行异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记,采用夹心免疫检测原理建立了牛生长激素免疫亲和色谱柱上荧光检测方法,使牛生长激素释放因子的检测下限达到200ng/L
药物分子或手性药物的对映体由于在体内与生物活性分子(如血浆蛋白)之间相互作用存在差异,因此它们在体内的代谢过程以及生理活性表现出明显不同。利用生物活性分子作为配体的生物色谱可以有效地应用在手性药物的拆分以及中药的成分分析、活性成分和药物先导物的筛选上。目前已利用微透析和生物分子色谱联用技术测定了药物和人血清白蛋白之间的立体相互作用。
2 基体辅助激光解吸电离生物质谱
生物质谱的兴起源自于人们对生命科学过程中有关活性物质分析的迫切要求,而新的质谱电离技术的出现,尤其是基体辅助激光解吸电离技术(MALDI)和电喷雾电离技术(ESI),为质谱从近代结构化学和分析化学领域进入生命科学范畴提供了可能性。生物质谱主要用于解决两个问题,一是精确测量生物大分子的相对分子质量,并提供它们的分子结构信息,二是对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子活性物质进行定性或定量分析。目前生物质谱已在多肽、蛋白质、寡核苷酸、多糖和寡糖等生物样品的分析与结构鉴定方面获得广泛的应用。而在临床医学分析方面,通过微量体液中标记物的快速测定,质谱可以为癌症等疾病的早期诊断提供有效的手段。

MALDI生物质谱是使一些易吸取激光能量的弱有机酸碱类物质作为基体先吸取激光能量,之后再将能量传递给样品分子,使样品分子获得足够的能量气化,得到完整的分子离子质谱峰。基体的引入克服了由于过量的激光能量直接轰击样品而使得样品裂解的问题,从而可以对大分子物质进行精确的质量分析,目前可测定的最大相对分子质量超过1500000。通常基体分子起着能量传递、样品分子隔离以降低解吸能以及质子化或去质子化剂的作用,而对其系统的研究结果表明,作为基体物质必须具有一定的可溶性、光吸取性以及比较低的反应活性,且一般含有苯环及一个至数个羧基、羟基或伯氨基。常用的基体有α-氰基-4-羟基-肉桂酸、25-二羟基苯甲酸和3-羟基吡啶甲酸等。利用MALDI生物质谱,主要开展了以下三方面的工作:(1)中草药MALDI分析。目前中药材的鉴别方法主要为色谱法、紫外及红外光谱法,相对分析时间比较长。MALDI质谱除具分析速度快、灵敏度高的特点外,还具有抗干扰能力强及可以用于复杂体系中混合物同时测定的特点。利用该技术对中药进行分析,通过对不同产地药物提取物进行质谱分析得到对应质谱图,通过指纹峰和专属性较强的峰来判断药物的真伪,从而建立中草药的MALDI指纹谱库,对中草药进行快速鉴别。(2)固定化酶蛋白质肽谱分析。在游离酶肽谱分析中一个比较大的缺点是酶自水解产物会干扰分析结果,同时酶寿命短不能重复利用,而这个问题可以通过固定化酶水解蛋白质来避免。通过共价或金属螯合的方法,在不同的载体如甲基丙烯酸缩水甘油酯复合膜、多孔硅以及石英熔融毛细管上键合蛋白酶制得酶微反应器,并将其用于蛋白质的肽谱分析。其中利用毛细管管壁共价键合胰蛋白酶微反应器,5min内对9fmol的马心细胞色素C成功地进行了肽谱分析,获得了76%的序列覆盖度。(3)小分子分析。通过使用多孔硅材料,能够有效的克服使用有机基体分析样品时所带来的基体信号干扰问题,因而十分适合药物等小分子的分析。同时通过处理多孔硅表面而键合上特定官能团,可以进行物质相互作用研究、蛋白质肽谱分析。在硅表面键合牛血清白蛋白得到亲和质谱靶,然后用质谱检测药物分子与靶体上共价键合的蛋白质的分子识别作用情况,从而为药物的筛选提供了质谱快速检测的途径,同时通过对多孔硅制备工艺的改进和微加工技术的引入,可以进一步实现生物活性分子识别作用的高通量筛选技术。表面活性剂与常规有机基体的混合物和碳纳米管作为MALDI的基体,可以有效抑制基体信号的产生,对一系列小分子化合物成功地进行高通量分析。
 

 
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