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联用技术应用于元素形态分析的新进展
编辑:澳门赌搏网站大全 文章来源:澳门赌搏网站大全 点击数: 更新日期:2012-06-25
 

痕量元素形态分析在环境科学、临床化学、毒理学和营养学方面的重要性日益增加。气相色谱与电感耦合等离子体质谱(GC-ICP-MS),高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)及电喷雾离子化质谱(ESI-MS)联用技术在元素的形态分析中发挥了重要的作用。目前,联用技术已应用于生物分子中的形态研究,研究对象已从环境降解产物转移到内源性的生物合成的金属(类金属)化合物。分析方法的发展要求结合不同学科的研究成果以解决在复杂的生物样品中痕量元素的形态分析难题。
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样品处理

血浆、乳清和尿液等样品经过过滤和稀释后可直接进入色谱柱。硒氨基酸为水溶性,用热水可浸取出与大分子结合的硒化合物。样品用水搅匀,经超声振荡加热处理和超声离心,硒浸取约为10%。含硒酵母中的硒也会全部被提取,硒氨基酸可用超滤或透析分离,硒半胱氨酸(Secyt)和某些硒氨基酸容易氧化降解,用羟甲基衍生物可以稳定secyt以防其降解。
由于水浸取的回收率低,Casiot等用十二烷基磺酸钠溶液作为浸取液以释放与蛋白结合的硒。用解朊酶混合物使化合物降解,从而使硒的回收率达到95%。
处理固体样品的困难在于保持初始的形态不变。处理的方法既要考虑到有较高的回收率,也要保持初始的化学形态。在分析生物样品时常用朊酶提取,使多肽键断裂以释放氨基酸。也有人用盐酸水解。
Michalke用几种不同的提取液分别提取细菌样品中的硒,提取率分别为1(热水)8(朊酶,HCI水解)12(溶菌酶楇妹?/FONT>)。其中溶菌酶辅助法可得到多种硒化合物,溶菌酶从细菌壁上提取硒化合物,朊酶再将其断裂。热水的效果最差,仅提取了单一的未知物。
海洋生物如海藻和鱼类中提取砷糖一般用甲醇-水溶液(11),超声振荡后离心,取出提取液,重复操作两次,在减压条件下,用旋转蒸发仪于30℃去除溶剂。残渣溶于水后,保存于4℃
从海洋生物中提取胞液(Cytosol)分析其中的金属硫蛋白(MT)。首先将生物样切断,在缓冲溶液(10mmol·L-1Tris/HCl+5mmol·L-1β-巯基乙醇+0.1m01L-1甲基磺酸氟化物,pH7.4)中国足球协会超级联赛声振荡后,离心。澄清液在60℃加热15min后,离心除去不溶物,取出溶液在-20℃保存备用。
2分离与检测
2.1气相色谱分离
Bouyssiere等总结了GC-ICP-MS联用技术应用于形态分析的装置和方法。讨论了各种接口方式如直接连接、室温连接、部分加热、全加热和通过喷雾室连接。各种方法都有各自的优缺点。填充柱气相色谱由于分析物在柱上的高度分散导致分辨率不如毛细管气相色谱。后者在分离挥发性化合物如Me4HgMe2Hg时可避免溶剂干扰,但因取样少而灵敏度下降。近年来提出的由9002000支毛细管组成的毛细管束克服了两者的缺点,并且仍然保持了各自的优点。毛细管束气相色谱与ICP-MS联用技术对汞的检测限可达0.08 pgSHg
GC-ICP-MS的另一进展是用涂有手性固定相的熔融毛细管柱分离营养液中的DL-硒代蛋氨酸(SeMet)对映异构体。
2.2 高效液相色谱分离
HPLC-ICP-MS联用技术在元素化学形态分析中的应用,已有文献总结;该技术的优点是应用范围广。以下是几种常用于形态分析的HPLC技术。
2.2.1 体积排阻色谱(SEC)
SEC是按溶质的分子大小来分离的。其优点是:未知分子质量的样品在末端时间或在此之前淋出,因而可以预测色谱运行的终点;未知物的分子质量可以用校正的色谱系统来表征。SEC通常不会引起元素形态的丢失,适用于不稳定或与金属络合较弱的生物大分子。缺点是容量有限,不能分辨多组分样品,仅能分离分子大小不同且不能吸附在柱上的分析物。此外,有些化合物的保留时间会迁移至淋洗体积的末端以外,有时还会产生吸附效应和憎水效应,这些现象均会导致化学形态的转变和破坏。
2.2.2 离子交换色谱(IEC)
SEC相比,IEC最主要的优点是分离效率高,应用范围广。分离过程基于带电溶质离子与固定相的反电荷表面的交换平衡。溶质离子与流动相中的等电荷离子竞争固定相上的反离子。这种竞争决定了离子的相对保留时间,它依赖于流动相的pH值、离子强度和离子交换剂的性质。淋洗液中如含有高浓度的盐类,将会影响与ICP-MS的接口。
此外不稳定的金属-蛋白的络合物中的金属会被缓冲液中的金属所代替。所以,IEC经常应用于以共价键结合的硒氨基酸或砷化合物。
2.2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)
RP-HPLC利用极性较流动相弱的固定相来分离分析物。保留机制是基于分析物的憎水性。该方法的应用范围广,对不同形态的分辨率高,重复性好。但是,固定相有离子交换性质,在pH>4时碱性分析物在柱上的吸附力很强。一般应用两种不同的淋洗液,其中至少有一种含有相当量的有机改进剂。淋洗生物分子需要用有机溶剂,还经常需要用酸。有机溶剂和酸很容易改变形态如蛋白-金属络合物。蛋白质被打开后,释放的金属即与其它络合剂结合导致形态改变。所以,RP-HPLC适用于分离以共价键结合的金属络合物而不适用于不稳定的金属络合物。
2.2.4 离子对色谱(IP-RPLC)
RP-HPLC仅能分离非极性不带电的分析物。在分离带电的极性分析物时需要用离子对试剂。固定相是标准硅烷化的硅胶填料(C8C18),流动相是由如磷酸盐或醋酸盐、有机改进剂(甲醇或乙腈)和离子对试剂组成的水溶液缓冲体系。离子对试剂与分析物生成离子对保留在反相柱上。离子对试剂参与流动相中分析物与非极性固定相之间的平衡。在考虑离子对试剂时应尽量用溶于流动相的去质子的一价反离子,并对色谱柱和分析物不造成损害。用缓冲溶液控制水相的pH值和反离子的浓度以避免峰拖尾和出现多峰至关重要。与RP-HPLC相比,IR-RPLC的优点是方法的灵活性和多样性增加了。可以为一种特定的要求来设计分离条件。但是,方法所用的有机溶剂和酸也会影响元素的形态。离子对试剂更加重了这些问题,于是对分析物的稳定性的要求比单独使用RP-HPLC更高。
2.3 毛细管电泳分离
毛细管电泳(CE)与紫外和可见光检测已用于金属硫蛋白(MT)的分离。近年来CE-ICP-MS应用发展较快。CE-ICP-MS多用于MT的分离和金属的检测。CE-SFMS联用可以通过同位素稀释法测定分离后的氨基酸中的硫来定量MT异构体。联用技术的关键在于接口。有多种技术如微型同心、超声、直接注人和高效雾化器。
2.4 电感耦合等离子体质谱(1CP-MS)检测
ICP-MS的最大优点是测定的灵敏度高、选择性好,又具有多元素和同位素的检测能力。扇型磁场等离子体质谱仪(sf-ICP-MS)的灵敏度较四极杆质谱仪(q-ICP-MS)的灵敏度高10100倍。装有保护电极的仪器还可高出1000倍。q-ICP-MS的分辨率为300,在4080质量范围内往往会遇到多原子离子的干扰。然而,sf-ICP-MS的分辨率可达700010000,具有足够的分辨本领以区分多原子离子和元素同位素质谱峰。
时间飞行等离子体质谱(TOF-ICP-MS)对检测瞬时信号较为理想,TOF-ICP-MS的高频率(>2 000s-1)能配合高速色谱提供全部质谱图。最近有报道,q-ICP-MS也能替代TOF-ICP-MS的某些应用。最新推出的q-ICP-MS的灵敏度并不比单离子检测的TOF-ICP-MS差。TOF-ICP-MS适用于作示踪试验的诊断工具,如在金属的生物挥发过程中研究同位素的分馏反应以及在快速分离过程中挥发性金属(准金属)的快速监测。
2.5 电喷雾质谱(ESI-MS)鉴定
ESI-MS用串联形式,从化合物经撞击诱导解离(CID)得到的碎片离子可以判断初始化合物的分子结构。但是生物提取液经过HPLC分离后仍然有大量信号出现在质谱图中,难以确定何种离子需要进一步用串联质谱分析。ESI-MS技术的灵敏度低,易受基体干扰,信号受到抑制。在分析物纯度不够时,不能确切的得到分析物的分子结构。所以,在用ESI-MS分析前,需要用多种纯化和分离方法,以获得尽可能纯的分析物。
2.5傅里叶变换回旋共振质谱
FI-ICR-MS具有很高的分辨率和质量测定的高准确度。在常规分析中分辨率可达十万分之几。测定离子的准确度优于1×10-6,分析质量数为数百Dalton(Da)时,m/z的测量能准确到6位小数,可区分CO27.9949DaN2 28.006 1Da。砷是单一同位素,砷是质量不足元素,准确的质量为74.921 6Da,比规定质量75Da低很多,在ESI-MS谱图中识别砷会有困难。利用FI-ICR可以找出砷的化合物,FI-ICR已应用于复杂生物体中砷的形态分析。
3 结 语
近年来在元素形态分析方面已取得了较大的进展。应用多种手段(SECRP-HPLCAEXCEXFPLC)和平行检测技术(ICP-MSICP-SFMSICP-TOFMSESI-MS)在生物体中发现了一些新的硒、砷和镉的络合物。但是由于生物样品非常复杂,待测分析物由于得不到标准物质可供参考,鉴定未知化合物的化学结构尚有困难。估计今后在络合物的提取、提纯、分离、检测以及鉴定方面将会有更多的研究工作发表。同时,随着分离和鉴定工作的不断改进,有望在天然植物中制备出新的标准参考物质。
 
 
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