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固相微萃取新技术及其在生物样品分析中的应用
编辑:澳门赌搏网站大全 文章来源:澳门赌搏网站大全 点击数: 更新日期:2012-06-25
 
摘 要:固相微萃取是基于萃取涂层与样品之间的吸附/溶解-解吸平衡而建立起来的集进样、萃取、浓缩功能于一体的技术。综述了固相微萃取技术的最新发展动态,先容了管内(in-tube)固相微萃取、新型萃取头以及固相微萃取与其他分析技术的联用情况和在生物样品分析中的应用实例。
关键词:固相微萃取;样品预处理;吸附-脱附平衡;生物样品
1989Belardi Pawliszyn 提出固相微萃取(solid-phase microextractionSPME)技术以来,众多分析工编辑对其进行研究,使该技术得到进一步的发展及广泛应用。固相微萃取技术是在一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(称为萃取头),再将萃取头直接浸入样品溶液(即直接浸没-固相微萃取方法,简称DI-SPME)或采用顶空-固相微萃取方法(HS-SPME)采样。由于聚合物涂层的种类很多,因而可对样品组分进行选择性富集和采集,然后将吸附组分热脱附或淋洗脱附后对样品进行气相色谱(GC)、液相色谱(LC)及毛细管电泳(CE)等分离分析。使样品预处理过程大为简化,提高了分析速度及灵敏度。其检出限的数量级为ng/g ~ pg/g,相对标准偏差小于30%,线性范围为3 ~ 5 个数量级。该技术集样品的萃取、浓缩与解吸于一体,具有操作简便、仪器价廉、灵敏度高的特点,且能极大地节约劳动力、时间和萃取溶剂,易于自动化和与其他技术在线联用。与其他常用的富集技术相比,克服了传统的液-液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作步骤多的缺点。SPME 与近年来新发展的样品前处理技术相比也具有独到之处,如:超临界流体萃取装置价格昂贵,不适于水样分析;以溶剂脱附的固相萃取法回收率低;热脱附的固相萃取法需要专用的加热装置,且固体吸附剂的孔隙易被堵塞。由于SPME可与GCLCCE联用,因此已用于分析蛋白质、极性的生物碱、药物和表面活性剂等物质。
1 取样方式
SPME 取样方式有两种:直接和顶空。直接取样是将纤维头直接插入液体样品中或暴露于气体中,尤其适于气态样品和干净基体的液体样品。水样与涂层接触时会形成一层水膜,阻碍水中有机物向涂层扩散,导致萃取时间较长。一般都采用搅拌的方法来加速萃取平衡。
对于挥发和半挥发性样品,顶空进样应用较多。因为顶空时样品基体不与萃取涂层直接接触,既保护了涂层,延长其使用寿命,又缩短了萃取平衡时间。对于固体及含润滑油、高分子质量腐殖酸的废水等不能直接取样的样品,可用顶空取样。与传统的顶空取样方法相比,顶空-固相微萃取由于顶空中的分析物被浓缩富集在固相微萃取涂层上,因而能提高检出灵敏度几倍到几十倍。但实验条件相同时,顶空吸附量小于直接吸附量。顶空取样涉及顶空气体(气相)、待测样品基体(液相)及萃取涂层(固相)三相平衡,影响顶空取样的因素很多。如顶空时搅拌水样可连续产生新鲜表面,从而加速分析物从水到顶空的质量迁移。顶空取样要求有一个最佳温度,温度升高,则更多分析物从基体中释放到顶空,使顶空的分析物浓度增加。但温度升高,分配系数会降低。顶空体积的大小对检测的灵敏度、方法的精密度及萃取效率有重要影响。顶空体积增加时,萃取效率降低;Camarasu 的研究表明,顶空体积小于样品瓶体积的1/3 时,灵敏度增加但精密度降低。10 mL的顶空瓶,最佳顶空体积为3mL对顶空瓶稍微施加压力会改善检出的灵敏度。但施压过大有顶空瓶的密封、顶空混合气体中气体B的物质的量分数变小和瓶的耐压问题。除了静态顶空进样方式外,还有动态顶空进样。动态顶空进样与吹扫捕集类似,吸附管填充聚二甲基硅烷(PDMS)颗粒以取代Tenax担体,因为PDMS Tenax 担体有更好的惰性。
2. SPME 联用技术
2.1 SPME-GC 联用
SPME-GC 联用装置已商品化,它貌似一支微量注射器,萃取头是在一根石英纤维上涂上固相微萃取涂层,外套细不锈钢管以保护石英纤维不被折断,纤维头可在钢管内伸缩。将纤维头浸于样品溶液或顶空气体中一段时间,同时搅拌溶液以加速两相间达到平衡的速度,待平衡后将纤维头取出插入气相色谱汽化室,热解吸涂层上吸附的物质。若样品较脏,纤维头插入GC 进样器之前要在蒸馏水中快速清洗一下,除去盐、糖、纤维、水溶性蛋白和脏物。
Arthur 等人对Varian model 8100 自动进样器进行改良设计实现了自动化操作,与手动操作相比,定量分析的精密度得到改善(RSD 达到 5%,手动操作的RSD20%)。Grote 等人将进样、样品制备、萃取、色谱分离、检测全部实现自动化,以聚丙烯酸酯(PA)为涂层,测定了德国化工厂废水中24 种极性化合物。顶空池容积5.3mL,样品体积2.5mL,用火焰电离检测器(FID)检测,对氯苯、氯酚等极性化合物的检出限为0.1 μg/L ~ 5μg/L,精密度(以 RSD 表示)达到1% ~ 7%
2.2 SPME-HPLC 联用
SPME-HPLC 联用目前主要有两种设计,一种是由Chen 等人提出的、采用传统的外表涂有涂层的纤维头,其SPME-HPLC 联用界面包括一个六通进样阀和一个解吸池,样品萃取后,SPME 纤维头浸入解吸池中用适当溶剂解吸,之后将阀切换至进样位置,用HPLC 分析检测。另一种是由Eisert 等人提出的in- tube- SPME。这种设计是将涂层涂在石英管的内表面,因此可采取GC毛细管柱涂层的方法,并将GC毛细管萃取柱放于HPLC自动进样阀和取样针之间。用注射器吸入样品,当样品待测组分分配到毛细管内壁固定相上时,将阀切换至取样位置,以适当溶剂解吸后将解吸溶液转移到样品管中,再切换至进样位置,样品管内溶液随流动相进入HPLC 柱。这种设计的优点是涂层方便易得,种类多样;易于实现自动化,节省分析时间;比手动分析有更好的精密度。目前常用的GC 毛细管柱涂层有:SPB- 1, SPB-5, PTE- 5, Supelcowax, Omegawax 250 等。
Pawliszyn 等人用自动化的in- tube- SPME- HPLC- MS 测定了环境中的三丁基锡,以Supel- Q 多孔层开管柱(PLOT)为萃取相,方法的检出限为0.05μg/L
SPME- HPLC 联用时采用溶剂解吸,分为动态解吸和静态解吸。动态解吸是将溶剂以一定流速数次流过萃取柱来解吸样品;静态解吸是将萃取柱浸入溶剂数分钟来解吸样品。可用作解吸的溶剂有:乙腈、甲醇、四氢呋喃、丙醇、丁醇、二乙醚、环己烷及己烷等。有人曾对以上溶剂的解吸情况进行了考察,结果表明,测定氨基甲酸酯时用甲醇最佳,四氢呋喃、乙醚因为不纯而不适合作洗脱溶剂;环己烷和己烷的解吸效率低。关于溶剂解吸,除了要选择合适的溶剂外,还要对溶剂的用量及流速进行考察。溶剂用量不足,解吸效率低;选择合适的解吸流速可以改善峰扩宽及拖尾现象。溶剂解吸的缺点是样品遗留问题,加热可以促进解吸,减少样品遗留,但受化合物热稳定性的限制。
2.3 其他联用技术
2.3.1 In- tube- SPME- GC
In- tube- SPME 最初用于与液相色谱的联用,但由于毛细管柱方便易得,并且内径小、涂层薄,与传统的SPME 外涂萃取针相比样品扩散快,平衡时间短,因此人们考虑也将其用于气相色谱中。一种方式是热解吸:用注射器将样品溶液注入毛细管柱,萃取平衡后将水吹出,然后用石英压封接头将萃取柱与分析柱连接,放入气相色谱仪炉箱中热解吸。另一种方式是溶剂解吸:将水样用氮气以极缓慢的流速吹入毛细管萃取柱中,再将水吹出萃取柱,将适当溶剂注入萃取柱中解吸,收集解吸溶液注入气相色谱仪中进行分析。由于解吸溶液的量较大(100 μL),因此GC 采用保留间隙柱实现大体积进样,可以测定水中10 μL / L 的酚,RSD 2% ~ 18%
2.3.2 SPME 分光光度法
Out 等人将PDMS 涂层用液体离子交换剂2-乙基-2-己基磷酸(HDEHP)改良,使之产生微孔以进行离子交换,测定了硝酸中的Bi(Ⅲ)。萃取后的Bi(Ⅲ)再用酸性KI 溶液吸取,产生黄色BiI4,用分光光度法测定。SPME 与紫外光谱联用测定水中芳烃化合物时,PDMS 被涂在小薄片上,PDMS的总体积为80 μLRSD3%~12%,检出限为0.4μg/L~12 μg/L
2.3.3 SPME-红外光谱(IR
红外光谱可提供定性结构信息,但灵敏度低,而SPME 可富集样品解决灵敏度低的问题。有报道将SPME 与红外光谱联用测定易挥发物、硝基苯、氯代烃。Yang 等人将中空的红外光导纤维管内表面涂上5%的聚异丁烯(polyisobutylene, PIB)疏水膜,用于收集土壤中的挥发性氯代芳烃,然后采用FTIR 检测,测得3 种氯代芳烃1- CNCB2-CT 的检出限分别为400 μg/ L905 μg/ L 707 μg/ L
2.3.4 SPME 电解分析
将以石墨为涂层的萃取针作为工作电极,Ag/ AgCl 为参比电极,将两电极浸入到加有缓冲液的样品溶液中,待测的二胺在电极上发生氧化还原反应,二胺转化为碱形式保留在涂层上,再将其插入气相色谱汽化室热解吸。用该方法测定葡萄酒中的1, 4- 丁二胺(putrescine)和1, 5- 戊二胺(cadaverine),检出限分别为270 μg / L 11 μg / L。另外,将聚合物涂层换成金涂层的萃取针用作工作电极测定Hg,检出限为0.88 μg / L
2.3.5 SPME-毛细管电泳(CE
Wang 等人将涂有PA 的外径为40 μm 的石英纤维直接插入内径为75 μm 的毛细管中,实现了SPME CE 的零死体积连接,测定了环境中的酚类化合物。用紫外检测器检测五氯酚,检出限为2 μg / L
2.3.6 SPME-ICP-MS
Mester 等人将SPME ICP- MS 联用测定AsSeSb Sn,热解吸部件采用气相色谱不分流玻璃内衬,并将其放于等离子炬底部。AsSeSb Sn 的检出限依次为70ng /L5300 ng/ L8 ng /L 310 ng /L
2.3.7 SPME-微波辅助萃取(MAE)-GC
顶空法不适于检测固体样品中的难挥发物。若将固体用溶剂溶解,溶剂又会与SPME 涂层竞争对分析物的分配,并有可能使涂层饱和,从而使萃取效率降低。将SPME 与微波辅助萃取结合可解决这一问题。在固体样品中加水,水吸取微波能,再升高温度并增加压力,使分析物从固体中溢出,最后用SPME 进一步富集。采用这种方法富集食品中的2- 甲基-3- 羟基- 4- 吡喃酮(veltolR))和2- 乙基-3- 羟基-4- 吡喃酮(veltol- plusR)),再经GC- MS 检测,检出限分别为10 μg / L 2 μg / LRSD 小于13%
此外,Wu等人利用聚吡咯(polypyrrolePPY)的阴离子交换特性,将SPME与离子色谱联用,无须衍生就能测定水溶液中的阴离子。Jager 等人用PDMS 为萃取涂层的SPME与拉曼光谱联用测定水中的燃料油污染物。他们还将SPME 与紫外消失波吸取光谱法(UV-EWA)联用检测水中芳烃,结果二甲苯的检出限为1.42 mg/L,苯为18.2 mg/L
3 固相微萃取改进技术
3.1 便携式动态空气进样装置(PDAS
便携式动态空气进样装置实际上是SPME 用于气体富集的改良型装置。Augusto 等人改装家用吹风,在吹风头前留有3 nm 狭缝,正对狭缝位置放置SPME 萃取针,样品气流垂直通过SPME 涂层,使达到涂层表面的分析物马上被吸附。非平衡态SPME 进样测定空气中易挥发物,比常规SPME 能吸附更多的易挥发化合物,涂层暴露于空气中30 s 可测定到μg/L 级,与NIOSH 1501 方法比较,分析速度快,样品用量少。
3.2 萃取头形式的改进棗微型搅拌棒
目前所用的萃取头主流是纤维针,内涂层中空毛细管式的萃取头的应用范围日益扩大,而微型吸附搅拌棒式的SPME 对目标分析物的吸附量比纤维针式的高出1 ~ 2 个数量级,并于2000 年商品化,主要用于食品中农药残留的富集分析。该技术是用吸附搅拌棒代替传统的石英纤维。吸附搅拌棒为内有铁芯的玻璃棒,长2 cm~4 cm,外径1 mm~2 mm,表面涂上或套上PDMS0.3 mm~1 mm 厚)。将其放入样品中搅拌约1 h,使分析物充分萃取在PDMS上,取出棒,用蒸馏水洗净,放在热解吸管中解吸,采用GC GC-MS 分析。这种微型吸附搅拌棒能有效地萃取奶昔、酸奶、果汁、植物和动物捣碎的浆液中的挥发和半挥发有机污染物。与传统的SPME 方法相比,最小检出量下降1~2 个数量级。
3.3 萃取纤维的改进
由于熔融石英纤维易碎,使用时需特别小心,因此人们考虑采用金属材料作为萃取头。Lipinski用内壁涂层的不锈钢毛细管柱代替常规的SPME 注射器针头,动态萃取水中杀虫剂,检测限显著降低。
Liu 等人将多孔硅通过高温环氧树脂粘在不锈钢丝上,萃取头吸附表面积显著提高,250 μm 外径的钢丝上粘上100 μm 的多孔硅涂层,其总表面积是聚合物涂层表面积的500 倍。通过在多孔层上涂渍或硅键合的固定相还可以提高萃取的选择性。
4. 固相微萃取新技术在生物样品分析中的应用
4.1 乙醇和挥发性物质
Kumazawa等人报道了从血液和尿样中分析乙醇的方法。他们使用聚乙二醇/二乙烯基苯(CW/DVB)纤维,在0.5 mL血样中加入Na2SO4,然后置于4 mL顶空瓶中加热至70℃,顶空萃取15 minGC分析只需7 min。他们同时提到:用聚二甲基硅氧烷(PDMS)纤维会更好,但乙醇的回收率低。随后这个研究小组改进了从人的各种体液中萃取乙醇的方法,他们在血样中加入(NH4)2SO4Na2S2O6,加热至60℃,用羧基/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)纤维进行顶空萃取。尿样的处理方法与血样类似。通过对萃取方法进行优化,检测灵敏度可提高3个数量级。
Brewer等人建立了顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用的方法(HS-SPME-GC-MS),用于分析与交通肇事相关的挥发性物质。该方法可对血样和气态样品中的乙醇、甲苯、氯化物及挥发性石油产品进行检测。由于不存在空气或溶剂峰,因而对挥发性成分的分析是很有利的。Grote等人对纤维的选择及潮气的去除进行了研究,并对采样温度和萃取时间进行优化,测得的检测限低至nmol/L级,线性范围为10 μmol/L ~ 500μmol/L
国内有人用65μm CW/DVB纤维,采用HS-SPME-GC 法测定了蜂蜜和蜂王精口服液中的痕量乙醇。Vergnais等人对分析葡萄球菌的挥发性代谢物进行了详细的讨论,包括纤维涂层及萃取条件的选择等。
4.2 氨基酸和蛋白质
氨基酸最常用的检测方法是先用荧光标记后,再进行HPLC分离和荧光检测。但Myung等人发展出用SPME-GC-MS检测半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的方法。
Liao等人已实现了用SPME-微量LC方法萃取和分离蛋白质。纤维涂层是聚丙烯酸,用作阳离子交换剂。该研究小组萃取了100mL 含有肌血球蛋白、细胞色素C和溶菌酶的液体样品,在短短的5 min ~ 10 min内即可达到萃取平衡;之后,用pH 6.70.02 mol/LNa3PO4溶液淋洗纤维头,以除去无关的杂质;然后将纤维放入0.02 mol/LNa3PO4(含0.5 mol/L NaCl)溶液中脱附5s,再对上述部分脱附液进行HPLC分析。这个例子向大家展示了SPME分析蛋白质化合物的潜力。
4.3 类固醇
Okeyo和他的同事们从血液和尿样中检测到7种雌激素和合成代谢的类固醇。由于许多类固醇是非挥发性的,且带有很多极性官能团,因此他们采用PACW/DVB纤维进行DI-SPME采样,然后在纯的双-(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)试剂顶空条件下进行衍生并于60℃保温1h,之后,按通常的方法进行脱附,做无分流GC-MS分析。他们对分析过程中的一些条件做了研究,包括萃取时间、样品的pH值和盐浓度、脱附温度及GC条件等。结果表明,由于各物质的官能团和化学性质变化太大,因此每种物质都有各自的优化条件,若要对混合物进行分析,应对测试条件进行必要的折中。
Volmer等人也用SPME-LC-MS测试到尿样中的皮质类固醇。他们考察了纤维极性、萃取时间和离子强度对萃取的影响,结果发现向样品中加入盐之后,离子化的化合物的萃取率提高了23倍。他们还运用SPME和液相色谱-电喷雾-二级串联质谱联用的方法(LC- ESI-MS-MS)研究了抗生素-A在水溶液中的分解。抗生素-A是一种抗细菌感染的大环内酯抗生素,在酸性环境中会产生脱氢反应。降解实验就是在室温条件下改变样品的pH值,用LC-MS鉴定视为主要降解产物的脱氢抗生素。他们采用PDMS/DVB纤维进行SPME采样,用三级四极质谱仪可鉴定出14种降解产物。
4.4 天然产物
植物样品的采样和预处理方法的进展在研究新的生物活性物质中是最重要的。针对这个目的,SPME具有非常吸引人的特点,例如能在偏远的地区进行野外采样等。
对用GC-MS分析中草药及中药材中的挥发性成分来说,HS-SPME是一种很有用的方法。PDMS纤维可从中药丸中顶空萃取出17种萜类化合物。有人运用HS-SPME-GC-MS方法,从新鲜的紫苏中鉴定出20多种挥发性成分。
Schafer等人应用HS-SPME分析了松树叶中的单萜。他们研究了PDMS纤维的涂层厚度、萃取时间和萃取温度对SPME富集效果的影响。与采用气密性注射器的传统的静态顶空采样相比,HS-SPME更易于操作,更易于实现样品的富集,因而很有吸引力。但多组分的萜烯混合物,其沸点范围较宽,气相与PDMS纤维间的分配常数变化较大,故萜烯的定量还需再进一步讨论。
5 展望
预计今后SPME 的研究发展方向主要有:(1)内涂固定相的毛细管萃取柱和热解吸方式。因为它方便易得、种类多样、易于自动化且耐用,而且不用溶剂。对于难挥发性物质的分析,In- tube- SPME- HPLC 的方法简单方便且灵敏准确,因此会在生化、药物、食品领域有很广阔的应用发展前景。(2)新型萃取头,如微型吸附搅拌棒。该棒不仅能提高富集量1 ~ 2 个数量级,而且能处理用其他方法难以富集的果汁、奶汁和动植物浆液的优点。
 
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